進行限制酶切割反應只需簡單地將酶和DNA樣品放在合適的反應緩沖液溫育，其中DNA和酶的量、緩沖液的離子強度、溫育溫度和時間都依具體的反應而改變。

DNA

TE 酶切緩沖液 EDTA

電泳儀

1.  混合下列溶液于一個無菌的微量離心管中

（1）x μl  DNA
（2）2 μl  10×酶切緩沖液
（3）18-x μl  H₂O

（4）20 μl 的反應體積可以方便地用于聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分析。
（5）只要反應混合物中其他成分的比例保持一定，可增減待切割DNA的量和反應條件。

2.  加入限制性內切酶（1~5 U/μg DNA）在推薦的溫度溫育1 h （—般是37℃）。
3.  理論上，1 U 限制性內切酶在推薦的反應條件下，60 min 內可完全消化1 μg 純化的樣品。
4.  酶的體積應低于反應總體積的1/10，因為酶液中的可以干擾反應。

5.  加入5 μl 電泳加樣緩沖液終止反應，進行瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳。

6.  反應也可通過加入0.5 μl 0.5 mol/l EDTA（終濃度為12. 5 mol/l） 以螯合鎂離于而終止。
7.  很多酶再65℃溫育10 min 可被不可逆滅活，有些不能在65℃熱失活的酶在75℃溫育15 min 也能失活。
8.  如果酶對熱具完全抗性，可遍過酚抽提和乙醇沉淀或通過硅基質懸浮法來純化DNA。